La Microbiologia Predittiva
Cos’è la Microbiologia Predittiva
La microbiologia predittiva è definita come “La scienza di descrivere e prevedere attraverso modelli matematici la risposta dei microrganismi al loro ambiente”. Questo scopo è stato raggiunto attraverso lo studio delle cinetiche di crescita delle popolazioni microbiche, in relazione alle proprietà intrinseche (pH, aw, % di NaCl, % NO2) ed estrinseche (UR%, temperatura, tipologia di confezionamento) degli alimenti.
Lo studio delle cinetiche batteriche ha portato alla formulazione di equazioni matematiche e successivamente allo sviluppo di software facilmente consultabili come strumenti per studiare la sicurezza e la stabilità degli alimenti.
I modelli predittivi
I modelli predittivi si fondano su database di dati raccolti da diversi laboratori internazionali durante prove di inoculo del microrganismo target in brodo colturale con diversi valori di pH e concentrazione salina.
I brodi sono stati incubati a diverse temperature e la concentrazione batterica è stata valutata nel tempo. I modelli risultanti consentono di estrapolare l’andamento di un microrganismo ad una data temperatura sulla base dei parametri di crescita del microrganismo stesso ad un’altra temperatura.
Negli ultimi anni sono stati sviluppati software costruiti sulla base di dati ricavati da prove effettuate inoculando i microrganismi sull’alimento. Ciò permette di superare il limite principale della predittiva, ossia la concreta possibilità che il comportamento microrganismi in terreno colturale sia differente rispetto a quello riscontrato nella reale condizione di un alimento.
I modelli possono essere consultati per diverse applicazioni:
- prevedere la shelf life di un nuovo alimento;
- validare processi produttivi e/o le loro shelf life nei confronti di diversi patogeni;
- stabilire se è necessario allestire un microbial challenge test;
- sviluppare e costruire un piano HACCP;
- verificare se una modifica nella ricettazione di un alimento, in termini ed esempio di riduzioni di
conservanti, possa costituire un rischio per il consumatore.
L’impiego della microbiologia predittiva è previsto anche nell’Allegato II del Reg. EU 2073/2005 che la colloca tra gli strumenti che l’operatore del settore alimentare può utilizzare per dimostrare che l’alimento prodotto rispetta i criteri microbiologici, fissati nell’Allegato I, per l’intera durata del periodo di conservabilità.
I software della Microbiologia Predittiva
Esistono diversi software di modellazione predittiva. Questi sono disponibili on line oppure scaricabili gratuitamente e possono essere impiegati per le finalità sopra descritte. Generalmente prevedono la possibilità di impostare diverse variabili tra le quali la temperatura di conservazione (anche come combinazioni di diverse temperature), il pH, la % di NaCl o il valore di aw.
Alcuni modelli prevedono anche la possibilità di valutare l’impatto di vari conservanti, tra cui nitrati/nitriti, CO2, acido lattico e acido acetico sulla crescita microbica.
ComBase
Tra i software maggiormente utilizzati, ComBase è particolarmente interessante poiché è strutturato in diverse sezioni consultabili a seconda delle esigenze.
Come riportato, ComBase fornisce una previsione dell’andamento di microrganismi patogeni o alteranti in diverse condizioni che caratterizzano l’alimento.
In alcuni casi viene modellato l’effetto di un quarto fattore ambientale aggiuntivo, come la concentrazione di anidride carbonica o acidi organici. I modelli possono produrre simultaneamente previsioni per un massimo di quattro microrganismi e sono anche in grado di prevedere il comportamento microbico in condizioni di temperatura dinamica.
Il software è suddiviso in tre sezioni principali:
- sezione “Broth models”, si articola in tre parti:
- Growth – restituisce previsioni curve di crescita
- Thermal inactivation – restituisce previsioni di inattivazioni logaritmiche in funzione della temperatura
- Non thermal survival– restituisce previsioni di sopravvivenza/inattivazione in funzione di aw, pH e, temperatura
- sezione “Food models” si articola in due parti:
- Perfringens predictor – restituisce previsioni del potenziale di crescita di Cl. perfringens durante il processo di raffreddamento di carni cotte.
- Salmonella in eggs – restituisce la previsione di crescita di Salmonella in ovoprodotti liquidi tra 10 e 42°C
- sezione “DMFit” – costruzione curve crescita sulla base di dati sperimentali
Le Sezioni del ComBase
Indipendentemente dalla sezione scelta, per poter effettuare la modellazione è necessario inserire nell’apposita schermata, i valori di aw e pH dell’alimento e la temperaura alla quale impostare l’elaborazione.
È possibile valutare quattro elaborazioni simultanee in funzione del microrganismo (previsioni multiple a temperatura statica) per confrontare quindi le risposte di un numero di organismi diversi a un singolo insieme di condizioni ambientali o di un singolo microrganismo a condizioni ambientali diverse.
Di seguito si riporta una descrizione più dettagliata delle due sezioni maggiormente utilizzate presso la divisione di Microbiologia per la stesura di pareri tecnici sulle validazioni dei processi produttivi e delle relative shelf life.
Broth models
“Growth Model”
Questa sezione consente di valutare le curve di crescita di diversi microrganismi, patogeni e alteranti:
- Aeromonas hydrophila,
- Listeria monocytogenes/innocua,
- Salmonella spp.,
- Clostridium botulinum,
- Clostridium perfringens,
- Yersinia enetrocolitica,
- Bacillus cereus, Bacillus subtilis,
- Bacillus licheniformins,
- Brochotrix thermosphacta,
- E. coli,
- Pseudomonas spp.,
- Shigella, Staphylococcus aureus
con la possibilità per alcuni di essi, di selezionare la presenza di particolari condizioni, quali la presenza di nitriti, di acido lattico o acetico, oppure di CO2 nell’atmosfera di confezionamento.
Si può anche impostare la modellazione con un profilo di temperature dinamico, così da prendere in considerazione le differenti condizioni cui un alimento può essere conservato (stoccaggio in azienda, presso la distribuzione o durante la conservazione domestica).
Il software restituisce un output della previsione sotto forma di un grafico della curva di crescita microbica in funzione del tempo; vengono dettagliati inoltre il tempo di latenza (lag time), la velocità massima di crescita, il tempo di duplicazione e la concentrazione massima raggiunta nel lasso di tempo selezionato. Una tabella separata fornisce tutti i dati puntuali di crescita in relazione al tempo.
Esempio di Output del Growth Model
Si riporta di seguito un esempio di predizione per Listeria monocytogenes ipotizzandone la presenza a concentrazioni inferiori a 10 ufc/g in un alimento con le caratteristiche del prosciutto cotto (aw=0,98 e pH=5,9) con shelf-life pari a 40 giorni; la modellazione è stata effettuata valutando le curve di crescita alla temperatura di refrigerazione di 4°C e a quella di leggero abuso termico di 8°C.
L’elaborazione risultante mostra due curve di crescita, una sigmoide gialla relativa alla conservazione a 8°C, l’altra viola relativa alla conservazione a 4°C.
La linea rossa può essere inserita parallelamente all’asse delle ascisse per fissare una concentrazione limite, oppure perpendicolarmente per fissare un punto temporale. In questo caso è stata utilizzata per valutare dopo quanto tempo fosse superata la concentrazione di 100 ufc/g, limite fissato dal Reg. EU 2073/2005 e smi per la concentrazione di Listeria monocytogenes che non deve essere superato durante il periodo di shelf life di un alimento RTE.
ComBase ha restituito una curva di crescita per Listeria monocytogenes a 4°C secondo la quale il patogeno dopo un periodo di latenza di
- 283 ore, inizia a crescere e supera la concentrazione di 100 ufc/g dopo 621 ore (circa 25 giorni);
- a 8°C diminuisce la fase di latenza a 130 ore e di conseguenza il tempo necessario per superare il limite fissato, 279 ore (12 ore).
In entrambi i casi valutati, si conclude che, in un alimento come il prosciutto cotto con le caratteristiche impostate, è necessario garantire l’assenza di Listeria monocytogenes altrimenti il patogeno sarà in grado di crescere nel prodotto e superare il limite di 100 ufc/g in un tempo variabile in funzione della temperatura di conservazione e della sua concentrazione iniziale.
“Non-thermal Survival Model”
Questa sezione del software ComBase restituisce previsioni di sopravvivenza o inattivazione di due patogeni,
- Salmonella spp. e
- Listeria monocytogenes/innocua,
in substrati per i quali è già stato dimostrato sperimentalmente che non è possibile il verificarsi di una loro crescita, nonostante i valori di aw e pH.
Le modalità di impostazione dei parametri sono le medesime descritte precedentemente. In questo caso però è possibile eseguire unicamente elaborazioni a temperatura fissa. Di seguito riportiamo le elaborazioni effettuate per valutare l’andamento di Listeria monocytogenes durante una shelf-life di 120 giorni di un prodotto con aw=0,94 e pH=5,6 assimilabile ad un salame stagionato. Le elaborazioni sono state effettuate a 3 diverse temperature, 4, 8 e 12°C.
Le elaborazioni risultanti mostrano inattivazioni del patogeno direttamente proporzionali alla temperatura di conservazione; infatti dopo un periodo di latenza di circa 80 giorni, si registrano inattivazioni di 0,75 log ufc/g a 4°C, di 1,2 Log ufc/g a 8°C e di 2,3 Log ufc/g a 12°C.
Considerazioni Conclusive sulla Microbiologia Predittiva
Come spiegato, le potenzialità dei software di microbiologia predittiva sono molteplici. Queste costituiscono infatti un valido supporto ai tecnici delle aziende alimentari per la valutazione della sicurezza e della stabilità dei prodotti.
Risulta fondamentale ad esempio, in fase di sviluppo di un nuovo prodotto, effettuare la valutazione del rischio microbiologico per particolari microrganismi, quali ad esempio il Clostridium botulinum; la consultazione dei modelli predittivi può guidare la produzione per arrivare alla formulazione di un alimento con caratteristiche chimico fisiche, in termini di valori di aw e/o pH, tali da non consentire la germinazione di eventuali spore contaminanti la materia prima.
È comunque importantissimo sottolineare che, nonostante l’utilizzo dei software predittivi sembri semplice, la difficoltà consiste nella scelta del modello più adatto allo scopo, nell’applicazione della sezione corretta e non ultimo nell’interpretazione dei risultati.
Infatti, benché rappresenti un valido strumento per diverse applicazioni, le risposte fornite devono essere necessariamente integrate dalle competenze e conoscenze di microbiologi esperti, soprattutto nei casi in cui sia necessario valutare la sicurezza sanitaria degli alimenti.